W 1869 r. Polacy przygotowywali się do obchodów trzechsetlecia zawarcia z Litwą unii w Lublinie. Mistrz Matejko od trzech lat pracował nad obrazem, który miał upamiętnić to wydarzenie. Dzieło przedstawia chwilę uroczystego odczytania i zaprzysiężenia dokumentu, który zapoczątkował powstanie Rzeczypospolitej Obojga Narodów. Król Zygmunt August, wielki orędownik unii, zwrócony w stronę widza z podniesionym krucyfiksem w ręku, jest centralną postacią malowidła. Otacza go grono wyższych dostojników świeckich i duchownych zarówno z Korony, jak i z Litwy. Wśród tych osób są również ci, którzy albo nie doczekali podpisania aktu unii, albo byli z innych przyczyn nieobecni w lipcu 1569 r. na zamku w Lublinie. Ich wkład w dzieło unii był jednak na tyle duży, że Matejko ujął ich na swoim malowidle. Unia lubelska, której krakowski mistrz poświęcił swój obraz, na kilka następnych stuleci zdeterminowała dzieje Polski i Litwy, przez co uważa się ją za jedno z ważniejszych wydarzeń czasów nowożytnych.